低通量单细胞转录组测序—Smart-Seq2
技术介绍
单细胞转录组测序可以充分了解组织内细胞的异质性，已经成为基础科研和临床研究的重要研究手段。 Smart-Seq2可用于单细胞水平全长转录本的建库测序，用于研究细胞的分型、Marker基因以及细胞间基因表达的异质性。该技术也适用于微量细胞的转录组测序。
技术原理和路线
送样要求
| 样本类型 | 样本需求量 | 送样量 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 活体新鲜完整细胞；不适于经固定、染色等处理的样本 | 约 1-1000 个新鲜细胞，避免组织块，随细胞带入的液体体积不超过1~2μL | 单细胞转录组扩增，建议重复单细胞样本个数不小于 5 个 |
|
| 通常样本为动物体细胞或胚胎细胞，除此之外的其他样本类型 | 需与销售人员沟通确认，特别是经过特殊前期实验处理的样本 |
温馨提示:
低通量单细胞或微量细胞转录组测序文库可使用 Smart-seq2 方式构建，但单细胞或微量细胞转录本在样品收集、运输、保存等过程中都存在较高的降解风险，建议客户在细胞分离前仔细阅读以下几个方面并尽量遵循：（我司提供裂解液（PCR tube），根据客户需要提供 BSA 和 PBS 等）
（1）裂解液保存
收到裂解液后，于-20℃保存，裂解液容易起泡，后续操作过程中不宜强烈吹打或震荡；收集细胞前将裂解液冰上解冻，解冻后短暂离心（常温掌上离心机瞬离）。
（2）细胞分离环境
保证清洁的取样环境，例如使用紫外照射工作环境，依次使用 75%乙醇和RNAzap 喷洒手套以及工作台面等，实验人员请务必佩戴一次性无菌手套、口罩、帽子等，避免不带口罩手套情况下直接接触裂解液管壁；
（3）试剂耗材
操作过程中涉及 BSA 配制、转移裂解液等，请务必使用无 RNA 酶的滤芯枪头和无 RNA 酶的离心管，PBS 和 BSA 等试剂至少达到无菌标准。
（4）细胞分离
细胞分离有很多方式，无论采用怎样的细胞挑取或分选方式，均要保证细胞收集到裂解液里（避免过多气泡），细胞分离到裂解管后，将 PCR 管短暂离心，短暂于冰上放置，并尽快转移至-80℃或干冰中。
- 流式或其他细胞分选仪进行机器分选。如果分选过多细胞至裂解液中，可能存在废液体积较多的现象，会影响细胞裂解效果和后续试验。可考虑先分选细胞到 PBS 中，分选结束后离心尽可能去除废液，然后使用裂解液重悬细胞，转移到原裂解液管中。分选前的细胞应使用 PBS 或者0.1%BSA 的 PBS 清洗 2 遍和重悬，尽量避免使用培养基重悬细胞进行分选，如使用培养基重悬细胞进行分选，则应在分选后应进行离心尽可能去除培养基残留。
- 显微吸取。采用手吸管或口吸管等方式挑取单个细胞。尽量将细胞在含 0.1%BSA 的 PBS 液滴中清洗 2-3 遍后再挑取到裂解液中，该过程中使用干净毛细管，且避免多个细胞使用同一根毛细管，若毛细管数量有限，可在干净 0.1%BSA 的 PBS 中反复洗后重复使用。挑取多个细胞时一定注意废液量，最多不要超过 1ul，0.3ul 内最为理想。
- 其他方式，如激光切割等，激光切割要尽可能保持转录组的完整，且避免组织或切片使用甲醛等固定，激光切割按照不同公司的激光切割仪操作方式进行细胞的有效切割和收集。
- 废液体积：我司寄出的裂解液体积为 4ul，原则上要求客户分选细胞时带入的废液体积尽可能少，维持 0.3ul 内是最理想的情况，最多不超过 1ul。废液体积=分选或挑取细胞后的总体积-分选细胞前的裂解液体积 4ul。
（5）低温保存和运输
- 收集前：收集细胞前裂解液于冰上解冻，解冻后可短暂离心（保证裂解液在 PCR 管底），并始终保持在冰上。
- 收集后：分离单个细胞或者微量细胞到裂解液中，短暂离心后立即置于冰上，并尽快转移至-80℃保存，且尽快干冰运输。
- 除了短暂离心等无法保证低温的过程外，含或不含细胞样品的裂解液均应在冰上放置，且裂解液与冰应充分接触。从裂解液解冻到样品收集尽可能迅速，防止 RNA 降解，分离至裂解液中的细胞于-80℃保存的时间原则上建议不超过两周。
本公司寄送的 0.2mL 采样管，适用于显微操作细胞分离。若为流式细胞仪等大通量细胞分离仪器，需使用 96 孔 PCR 板收集的，请参考以下步骤：
- 此种情况下，我公司寄送空的覆膜 96 孔 PCR 板，附带整管足量裂解液、96 孔板底座、新的覆膜。不论取样前或取样后，避免裂解液和样本反复冻融；
- 裂解液解冻后轻轻颠倒混匀，稍加离心，避免起泡（尤其是分装转管时）；
- 操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下（如冰上或冰盒上）；
- 正式操作前先测试 96 孔 PCR 板，不要揭开覆膜，置于底座上，装载至流式细胞仪上取样位置。在四角、中间孔位先打数滴观察，调节流式细胞仪参数，确定落在覆膜上的位置为孔中央；
- 正式操作时，不要更换此底座，且保持 96 孔 PCR 板放入方向，避免错位；
- 正式板采样时需揭去覆膜，注意覆膜黏性较大。在所需孔位加入 2μL 裂解液；
- 将揭开覆膜的 96 孔板置于此前步骤 4 测试的黄板上；
- 根据流式细胞仪参数，以尽可能低的液体体积，将单细胞分离至管内裂解液中；
- 尽量保证细胞落至管底裂解液中，否则形成空载；
- 细胞采样后，贴上新的覆膜，做好标记；
- 轻拿轻放避免倾倒，防止液滴离开管底，将 96 孔板置于干冰上或-80℃先行冷冻；
- 之后尽快干冰运输，若需保存请置于-80℃；
- 后续下单进行扩增实验时，不能跳孔位，剪板操作困难且意外风险高。
常见问题
Q1：需要测多少个单细胞？
原则上单细胞数量越多越能反映组织内部的细胞异质性，客户可根据自己的组织材料特征决定细胞数量，如胚胎发育早期细胞数量少，能用于测序的细胞数量就少。
Q2：Smart-Seq2适用于哪些项目？
对于目的细胞数量少且单个细胞测序深度要求高的项目尤其适用；也可代替常规转录组，用于常规RNA提取效果不理想的微量bulk样品转录组测序。
Q3：单细胞分离方式怎样选择?
Smart2要求加入裂解液前的细胞尽可能是新鲜活细胞，可选择口吸管，流式分选等方式。具体收集方式可咨询领克销售人员。